犬瘟热分子生物学诊断技术研究进展【北京赛车

日期:2019-10-13编辑作者:纺织皮革

山羊绒和绵羊毛是轻纺界公认的技术难度最大的检测项目,传统的鉴别方法仅从动物纤维形态和化学性质来判断,很大程度上受制于检测人员的经验和鉴别能力。福建出入境检验检疫局研发的该项技术,首度将分子生物学方法跨学科应用于轻纺原料的鉴别领域,根据不同毛纤维遗传物质DNA存在的差异,利用基于DNA基础上的分子生物学方法(如实时荧光定量PCR法)从遗传本质上来鉴别山羊绒和绵羊毛,达到灵敏、准确、客观的鉴定效果,从而攻破了纤维原料和纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别技术难题。

3 分子生物学检测与诊断

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研发人员称,应用该技术,能够灵敏、准确、客观地鉴别山羊绒和绵羊毛,为鉴别假冒伪劣毛纺织品提供可靠的技术支持。同时,该技术能对残留毛织品纤维的痕迹进行分析,可为刑事侦察提供准确的技术佐证。

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬科、鼬科和浣熊科等多种肉食性动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。犬瘟热最早发现于18世纪后叶,1905年有人发现其病原为一种病毒。我国于1980年从患病犬体内分离到此病毒。犬瘟热的临床表现多样,特征性的示病症状很少出现,大多存在混合感染,因此准确、快速、特异性强的早期诊断方法在兽医临床中越来越重要。

针对以上问题,可以在以下几方面加强研究,以期达到“真伪优劣”鉴别的最终目标。

福建出入境检验检疫局近日宣布,该局自主研发的“山羊绒和绵羊毛的实时荧光PCR鉴别方法”,能对山羊绒和绵羊毛高效便捷作出鉴别,获得国家技术发明专利授权。

  1. 常规检测与诊断

 一、寻找进化速率快、种间高度变异的DNA序列进行测序分析。如叶绿体基因间隔区trnD-trnT,rpoB-trnC、trnH-psbA等。品种特征DNA序列的获得是将其转化为简易、高效的PCR鉴别以及高通量芯片鉴别的基础,同时大量序列的获得,也为中药材比较基因组学的研究提供了可能和基础。

摘要:犬瘟热是目前危害犬、毛皮动物和野生动物最严重的传染病之一。其临床症状复杂,大多存在混合感染,确诊尤其是早期诊断较为困难。早期诊断对于犬瘟热的综合防控和患病动物的救治具有重要的作用,近年来分子生物学诊断技术的不断发展,对犬瘟热的诊断具有重要意义。现对犬瘟热的分子生物学诊断方法等作一综述。

近年来,以PCR为基础的DNA分子标记鉴别技术在中药材真伪鉴别中发挥了重要的作用,同时,在多基源品种的鉴别及道地药材鉴别中也崭露头角,显示出了巨大的前景。以人参、西洋参的分子标记鉴别研究为例,可以清楚地看出中药材分子标记鉴别的研究轨迹。从1994年AP-PCR首次用于人参、西洋参的鉴别以来,已有24篇相关的报道,按照所用方法的不同可分为三种:①基于PCR技术的方法有18篇文献,其中利用随机引物如RAPD和Ap-PCR等的有9篇,利用特异引物如MARMS、SCAR等的3篇,AFLP的3篇,PCR-RFLP的3篇;②利用DNA测序技术的有7篇;③基于分子杂交的方法有1篇,主要针对重复序列。有的报道中同时使用两种方法,如同时使用ITS序列分析与RAPD、PCR—RFLP和RAPD等。根据各个文献发表时间及其使用的方法可以得到人参类药材分子鉴定的发展特点:①随机引物虽占据主导地位,但随着时间的推移,RAPD等方法逐渐推出舞台。无须预先知道基因组信息的特点,使RAPD在中药材分子鉴定上成为最主要的方法,但随着18S、matK基因的测序,新方法便得以诞生,如MARMS。同时,在RAPD基础上发展起来的方法也显示了极好的应用前景,如SCAR标记以及应用梯度PCR检测中药复方中人参的PCR引物均是从RAPD的特异条带中得到的。②序列分析是各种新方法应用的基础。植物核基因组中的rDNA是研究最为广泛的基因之一,其中18S、ITS以及5S已成功的应用与人参西洋参的鉴别,可以直接利用测序后的碱基变异作为鉴别指标也可以利用等位基因PCR直接检测变异位点,从而通过电泳就可达到准确的鉴别。等位基因PCR简单、快捷、目标明确,有非常大的推广应用价值。此外,叶绿体基因中的编码间隔区正逐渐成为分子系统学研究的热点,如参类药材对叶绿体基因中的matK以及trnC-trnD进行了测序。③简单、快捷、准确是分子鉴定发展的趋势。参类药材分子鉴定的历程基本是随机引物—序列分析—PCR-RFLP—AFLP—特异引物PCR,体现了由复杂向简单的过程。近两年来,特异引物的应用以及在复方中参类药材的成功检出,标志着参类药材的鉴定达到了十分完美的地步。但这些仅仅解决了药材的“真伪”问题,质量的“优劣”却仍然没有很好的方法,如山参与栽培人参、朝鲜人参与中国人参、美国西洋参与中国引种栽培西洋参的鉴别为我们提出了新的课题。

3.1 核酸杂交

中药材真伪的现代科学鉴别 中药品种繁多,应用历史悠久,产区广泛。由于地理和历史的原因,药材品种混乱,基源复杂,如仅《中华人民共和国药典》2000年版收载的534种中药材,即有143种为多基源(二基源以上),占收载总数的27%。加之中药的同名异物或同物异名现象普遍存在以及伪品、混淆品和误用品等因素,对中药的化学成分和药理作用的研究、制剂生产、临床疗效及推广使用等都有直接影响,严重影响了中医药的信誉。同时,即使是同种药材,由于产地不同、野生与栽培以及生长年限不同都表现出质量和疗效上的差异,这些问题为中药材鉴别方法提出了新的挑战,依赖经典形态分类以及传统鉴别方法已无法满足鉴别的需要。随着各种先进仪器以及分子生物学的发展,各种新的鉴别方法亦纷纷推出,如红外光谱鉴别、化学指纹图谱鉴别以及DNA分子标记鉴别等,中药材鉴别领域显示出了蓬勃的生机。

犬瘟热的确诊较为困难,尤其是早期诊断。但是随着分子生物学的发展,国内外先后建立了犬瘟热的核酸杂交等温扩增等分子生物学诊断技术,其方法比免疫学方法的敏感性和特异性更高,尤其在CDV的感染早期,尚未产生免疫应答的情况下分子生物学方法能够作出早期诊断。

 二、大力开发新型实用的中药材分子标记鉴别方法和试剂盒 。中药材DNA降解严重,合适的DNA提取

CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属,为有囊膜的单股、负链RNA病毒,病毒粒子呈多形性,直径一般在100~300nm之间。其抵抗力不强,对热、干燥、紫外线和有机溶剂敏感。

(哈尔滨市动物卫生防疫站,哈尔滨150016)

犬瘟热的临床症状依所处环境、感染毒株、感染动物年龄和免疫状态的不同而呈现多样性。病犬主要表现为双相热,呼吸道症状如呼吸道卡他性炎症,神经症状如肌肉痉挛和癫痫等,消化道症状如腹泻、呕吐和脱水等。病程一般为2周或稍长,发生卡他性肺炎和肠炎时病程可能较长,出现神经症状的病程最长。

左 楠

核酸杂交是一种分子生物学的检测技术,用放射性或非放射性物质标记的已知序列的单链DNA或RNA片段,检测样品中的DNA或RNA分子的特定序列,经放射自显影或显色反应将与探针特异性结合的靶序列显示出来,其敏感性高、特异性强。在应用核酸杂交技术对犬瘟热进行诊断方面,国内报道较少,国外研究较多。Ap-pel用DNA探针和单股RNA探针检测了CDV基因组和mRNA,获得了很高的灵敏度和特异性。Zurbriggen等用地高辛标记犬瘟热病毒NP基因互补的RNA作为探针,可检测到单个细胞中存在的犬瘟热核苷酸序列。王宏俊等在CDV基因序列中编码核衣壳蛋白的保守区内设计合成一对特异性引物,通过RT

PCR从CDV基因中扩增出一段430bp的cDNA,并制备出地高辛标记的核酸探针,经检测结果表明该探针可用于CDV的临床检测。

3.2 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应作为一种体外扩增DNA片段的技术已广泛用于DNA病毒特异性核酸的检测,具有省时、省力、敏感性和特异性高等优点。国内外已有许多通过RT-PCR检测CDV的报道。肖定福等根据CDV的NP基因设计一对引物,使用RT- PCR方法,从临床疑似CDV感染犬的淋巴细胞中检测到目的条带,表明该引物与反应条件适合于检测犬CDV感染。张洪亮等根据CDV疫苗株和野毒株H基因序列Nde I酶切位点的不同,建立了RT- PCR扩增产物经限制性片段长度多态性分析鉴别检测方法,为临床上犬瘟热病毒的鉴别检测和诊断提供了依据。

3.3 实时定量PCR

实时定量PCR(Real- time PCR)是在PCR的基础上发展起来的一种新的核酸检测技术,比普通PCR更迅速、灵敏、特异性强。目前实时定量PCR检测方法主要有SYBRGreen荧光染料掺人法和TaqMan探针法。TaqMan探针法特异性好,但是价格比较昂贵,染料法价格较为低廉,敏感性、特异性等也较好。黄国君等根据犬瘟热病毒NP基因序列,设计合成引物,建立了基于SYBR Green I的Real-time RT- PCR检测CDV的方法,与常规RT- PCR及胶体金检测技术进行了比较,结果表明敏感性比常规RT-PCR高103,比GIA高105。检测11例临床病例,检出率100%,为CDV的早期快速诊断提供了新的定量检测方法。全传松等建立的TaqMan实时荧光定量RT

  • PCR方法,其敏感性是常规RT- PCR的100倍,与其他犬类病毒不发生交叉反应。对67份临床样品检测,阳性检出率为64. 2%,高于常规RT - PCR阳性检出率20%,具有良好的敏感性、特异性和稳定性。

3.4 环介导等温扩增

环介导等温扩增( Loop - Mediated Isothermal Amplifi-cation,LAMP)是2000年日本学者Notomi等报道的一种新的恒温核酸扩增技术,是针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物,在链置换DNA聚合酶的作用下,在等温条件下,th完成核酸扩增。扩增反应产生焦磷酸镁白色沉淀,可通过肉眼来判断是否发生扩增。LAMP技术已在食品检测、临床疾病诊断等领域有着广泛的应用。何丽丽等根据犬瘟热病毒N基因设计2对LAMP引物,建立CDV环介导等温扩增检测方法。经检测,结果显示,该方法敏感性比RT- PCR高10倍,仅CDV产生阳性扩增,狂犬病毒、犬细小病毒和犬腺病毒Ⅱ型扩增结果均为阴性,临床样品检测结果与RT

  • PCR -致。杨天阔等[12]建立了鉴别CDV野毒株与疫苗株的反转录一环介导等温扩增方法,对反应体系和条件进行了优化,方法特异性高,敏感度是常规RT- PCR的100倍。

4 小结

犬瘟热作为对毛皮动物、犬和野生动物危害最严重的疾病之一,每年都会造成巨大的经济损失。由于其诊断复杂和困难,需要实验室诊断技术来进行确诊。虽然已有多种诊断方法成功应用于诊断,但在实际推广应用上仍存在一些问题。随着科学技术的不断发展,分子生物学的研究逐渐深入,新的分子生物学技术不断推出和完善,准确、快速、简便的对犬瘟热进行诊断和监测将逐步实现,对于犬瘟热的综合防控和有效治疗,保护毛皮动物养殖业、保障宠物犬和野生动物的健康具有重大意义。

1 病原与症状

依据临床症状和流行病学特点,可作出初步诊断,但犬瘟热病毒常与其他病毒混合感染,或引起细菌的继发感染,因此犬瘟热的临床症状表现复杂,只有将临床症状与实验室诊断相结合才能进行确诊。常见的实验室诊断方法有CDV的分离培养及鉴定、电子显微镜直观观察诊断和血清学检测与诊断等。其中血清学诊断在犬瘟热的实验室诊断中是较为可靠的诊断方法。相继建立起了补体结合实验、微量血清中和实验、免疫荧光试验等检测和诊断方法,其中免疫荧光技术是目前国际通用的犬瘟热诊断方法[养殖网:www.nczfJ.com/]。

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